Grundlagen der Kapillarzonenelektrophorese (CZE)
Der schematische Aufbau eines Kapillarelektrophorese-Systems geht aus folgender Abbildung hervor:
Aufbau eines Kapillarelektrophorese-Gerätes
Die Trennung wird in einer mit Elektrolytlösung gefüllten Quarzglaskapillare durchgeführt. Der Kapillarinnendurchmesser beträgt üblicherweise 25 µm bis 100 µm und die Kapillarlänge liegt zwischen 20 cm und 100 cm. Zur Erzeugung des elektrischen Feldes wird eine Hochspannungsquelle eingesetzt, die Spannungen bis zu 30000 Volt liefert. Das Volumen der injizierten Probe beträgt nur einige Nanoliter und die Detektion erfolgt möglichst nahe am entgegengesetzten Kapillarende. Aufgrund der kleinen Kapillardimensionen werden besonders hohe Anforderungen an die Probeninjektion und die Detektion gestellt, um eine hohe Nachweisstärke und eine gute Reproduzierbarkeit der Messungen zu gewährleisten.
Das Trennprinzip der CZE beruht auf unterschiedlichen Geschwindigkeiten der geladenen Analyten unter der Wirkung eines elektrischen Feldes. Die Geschwindigkeitsdifferenzen sind in erster Linie auf Unterschiede im Ladungs-zu-Radius-Verhältnis zurückzuführen.
Auf ein geladenes Teilchen wirken in einem elektrischen Feld die einander entgegengerichteten Kräfte f und F.
Die Kräftewirkung während der Trennung
Die Kraft f beschleunigt das Teilchen zu der entsprechenden Elektrode – positiv geladene Ionen (Kationen) zur Kathode und negativ geladene Ionen (Anionen) zur Anode. z ist dabei die Ladungszahl und e0 die Elementarladung, d.h. die Ladung eines Elektrons. Die elektrische Feldstärke E ist definiert als das Verhältnis der wirkenden Potentialdifferenz (in der CE die angelegte Spannung) zu dem Abstand der Elektroden, der in erster Näherung durch die Kapillarlänge gegeben ist.
Beschleunigende Kraft und Reibungskraft
Die Kraft F resultiert aus dem Reibungswiderstand, den das Teilchen bei der Bewegung durch die Elektrolytlösung erfährt. Sie ist abhängig von der Größe des Teilchens, dessen Geschwindigkeit und von der Viskosität der Lösung. Nach Einstellung eines Gleichgewichtszustandes folgt eine Bewegung mit konstanter Geschwindigkeit, die neben experimentell vorgegebenen Größen wie der elektrischen Feldstärke E (abhängig von angelegter Spannung und Kapillarlänge) und der Viskosität der Elektrolytlösung durch das Ladungs-zu-Radius-Verhältnis des Teilchens bestimmt wird.
Die Geschwindigkeit v
Zur Beschreibung der Bewegung in der Elektrophorese ist es oft sinnvoller, statt der Geschwindigkeit die Ionenbeweglichkeit oder elektrophoretische Mobilität µ zu verwenden, da diese eine stoffspezifische Größe darstellt und unabhängig von apparativen Parametern wie der angelegten Spannung oder der Kapillarlänge ist.
Die Definition der Mobilität
Die Ionenbeweglichkeit µ ist im Gegensatz zur Bewegungsgeschwindigkeit eine von apparativen Parametern unabhängige, substanzspezifische Größe. Sie kann aus den für viele Ionen bereits in Tabellenwerken erfassten Äquivalentgrenzleitfähigkeiten berechnet werden.
Zusammenhang von Mobilität und Grenzleitfähigkeit
Bei Verwendung von Quarzglaskapillaren wird die Eigenbewegung der Ionen durch den sogenannten Elektroosmotischen Fluss (EOF) überlagert. Bei Verwendung nicht modifizierter Kapillaren fließt dabei die gesamte Elektrolytlösung in Richtung Kathode und ist damit der Kationenbewegung gleich- und der Anionenbewegung entgegengerichtet. Dies ist bei der Einstellung der Elektrodenpolarität zu beachten, damit die Analytionen unter den gewählten Trennbedingungen in Richtung Detektor migrieren.
Das Prinzip einer Trennung
In der CZE wird die Trenneffizienz (N) von verschiedenen Faktoren beeinflusst. Von besonderer Bedeutung ist es, eine konstante Temperatur zu gewährleisten, da viele für die Trennung relevanten Parameter temperaturabhängig sind.
Prinzip der Peakverbreiterung
Elektrodispersionseffekte sind eine Ursache für die unterschiedlichen Peakformen in der CZE. Hierbei sind Mobilitätsdifferenzen zwischen Analytionen und Elektrolyt-co-ionen und das Verhältnis von Elektrolyt- zu Analytkonzentration entscheidend. Diese Kenntnis kann zur Trennungsoptimierung bezüglich der Auswahl der Elektrolytsysteme genutzt werden.
Die Beeinflussung der Migrationsfolge der Analytionen kann durch den Einsatz von Additiven erfolgen, die selektiv die Mobilität der Analyten verändern. So können z. B. durch Zugabe von Komplex- oder Ionenpaarbildnern Ladung oder Radius der migrierenden Spezies verändert und damit Trennungen optimiert werden.
Das folgende Beispiel zeigt die Trennung von Ammonium und Kalium mit Hilfe des Kronenethers 18-Krone-6. Aufgrund des fast identischen Ladungs-zu-Radius-Verhältnisses ist eine elektrophoretische Trennung der beiden Ionen über Mobilitätsdifferenzen nicht möglich. Der Kronenether beeinflusst die Mobilität von Kalium in Abhängigkeit der Additivkonzentration.
Beeinflussung der Mobilität
Der Einfluss von 18-Krone-6 auf eine Kationentrennung
Auch über den pH-Wert der Elektrolytlösung und der daraus resultierenden Ladungsänderung an den Analytionen, die Temperatureinstellung, die Wahl der Kapillardimensionen und des Kapillarmaterials kann eine elektrophoretische Trennung schnell und effizient entwickelt und optimiert werden. Damit bieten sich dem Anwender sehr viele Möglichkeiten, die Trennung zu beeinflussen, was zu einem sehr breiten analytischen Anwendungsspektrum der CE führt. Auf der anderen Seite ist es dadurch unbedingt notwendig, die optimalen Parameter zu wählen und diese konstant zu halten, um reproduzierbare Ergebnisse zu gewährleisten.
Ingo Haumann, ICA, 2012.